Caractérisation des exosomes isolés des milieux de culture cellulaire

Problématique / Besoin :

Les exosomes sont des nanovésicules naturellement éliminées par divers types de cellules. Ils sont intensivement étudiés en tant que véhicules potentiels d'administration de médicaments. Ici, nous démontrons que le Litesizer™ 500 peut caractériser efficacement la taille des particules d'exosomes et que ce critère peut être utilisé pour surveiller la stabilité des exosomes in vitro. Des mesures du potentiel zêta ont également été réalisées avec succès sur ces préparations à l'aide du Litesizer™ 500, donnant des informations potentiellement utiles sur la fonctionnalité biologique des exosomes. 

Méthode utilisée / Réponse apportée :

1. Introduction

Les exosomes sont des vésicules nanométriqes provenant de la fusion d'endosomes avec la membrane plasmique de cellules eucaryotes. Avec les microvésicules, qui sont produites par bourgeonnement direct de la membrane plasmique, elles peuvent être libérées dans l'environnement extracellulaire par une grande variété de types cellulaires. Les exosomes peuvent être isolés du milieu de culture cellulaire ainsi que de nombreux fluides extracellulaires tels que le sang, l'urine, la salive, le lait maternel et le liquide céphalo-rachidien. D'après l'analyse par microscopie électronique, les exosomes sont de minuscules vésicules dont la taille attendue est comprise entre 30 et 150 nm. Ils ont une bicouche lipidique similaire aux liposomes mais sont de taille plus hétérogène et ont une constitution beaucoup plus complexe. Ils peuvent incorporer (par exemple, des tétraspanines), des ARNm, des miARN, du cholestérol, de la sphingomyéline et principalement des acides gras mono-insaturés ou saturés. Alors que la pertinence physiologique in vivo des exosomes est encore largement incertaine, leur potentiel en tant que système d'administration de médicaments est reconnu depuis longtemps. Leurs nombreux avantages incluent une action de ciblage cellulaire à longue portée, une faible toxicité, une faible immunogénicité, une stabilité élevée et la capacité d'encapsuler des protéines, des médicaments ou des acides nucléiques. En tant que tels, ils sont considérés comme l'un des meilleurs candidats pour la thérapie ciblant le cancer. De plus, les exosomes deviennent de puissants outils de diagnostic, car le profil ARN et de protéines des exosomes circulants peut être associé à un éventail croissant de maladies. Dans ce rapport d'application, les exosomes isolés du milieu de culture cellulaire de cellules buccales humaines ont été caractérisés à l'aide d'un Litesizer™ 500 par des mesures de la taille des particules et du potentiel zêta. 

2. Configuration expérimentale

Culture cellulaire

La lignée cellulaire humaine TR146, un carcinome épidermoïde provenant de la muqueuse buccale, a été obtenue auprès de Cancer Research UK (Londres, Royaume-Uni). Les cellules ont été ensemencées sur des inserts filtrants en polyester Transwell® de 1,12 cm2 (taille des pores 3 m -Szabo Scandic, Vienne, Autriche) à une densité de 3,6x104 cellules/cm2 et cultivées dans des plaques 12 puits pendant 7 jours, à 37°C et moins de 10% de CO2. Le milieu de culture consistait en DMEM additionné de 1% de L-glutamine, 10% de sérum bovin foetal, 1% d'acides aminés non essentiels et 1 % de pénicilline/streptomycine (tous de Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne). 

 Isolement des exosomes

Le milieu de culture cellulaire a été collecté et centrifugé pendant 30 minutes à 2000 g pour éliminer les cellules et les débris. Les exosomes ont été isolés du surnageant à l'aide du kit d'isolement total des exosomes invotrogen™ (Thermo Fisher Scientific). Suivant le protocole standardisé fourni par le fabricant, 500 L de réactif d'isolement ont été ajoutés à 1 ml de milieu de culture acellulaire. Les échantillons ont été incubés au réfrigérateur pendant une nuit puis centrifugés à 10 000 g pendant 60 minutes à 4°C. Le surnageant résultant a été jeté et le culot d'exosomes a été remis en suspension dans 100 L de tampon PBS (pH = 7,4, Thermo Fisher Scientific). Dix échantillons identiques ont été préparés pour chaque condition expérimentale. 

Mesures de la taille des particules et du potentiel zêta 

L'analyse granulométrique a été réalisée sur des échantillons non dilués et dilués/filtrés. Les modèles d'analyse "Général" et "Etroit" combinés avec le modèle de cumulant "Avancé" ont été utilisés. Les mesures ont été effectuées à la fois dans l'angle arrière (175°) et dans l'angle latéral (90°). Les mesures ont été répétées 3 fois pour chaque angle de mesure. Le nombre maximum d'analyses, le filtre et position de mise au point ont été automatiquement sélectionnés par l'instrument. Les mesures du potentiel zêta ont été réalisées dans des cuves Omega en mode série, avec 3 répétitions. La tension et le nombre de courses ont été automatiquement sélectionnés par l'instrument. Toutes les mesures ont été effectuées à 25°C. 

3. Résultats et discussion

Optimisation de l'angle de mesure et du modèle d'analyse

Plusieurs tests ont été effectués sur des échantillons non dilués et dilués. Dans tous les cas, un pic discret a pu être observé dans la plage de tailles de 10 à 100 nm, ce qui correspondait à la plage de tailles attendue des exosomes. En moyenne, la granulométrie moyenne de ce pic était d'environ 34 nm. Pour les échantillons non dilués, les meilleurs résultats en termes d'intensité moyenne, de densité optique du filtre et de fonction d'autocorrélation ont été obtenus en utilisant le modèle d'analyse "Narrow" et l'angle de mesure de la dispersion latérale (90°). Cependant, la résolution du pic était médiocre, car le pic correspondant aux exosomes (diamètre 30 nm) formait un continuum proche avec un pic de particules plus grosses (200 nm), correspondant probablement à des débris cellulaires. Cela suggère que les exosomes s'agrégeaient avec des débris cellulaires (par exemple, des corps apoptotiques) dans cet échantillon. 

Afin d'augmenter la pureté de la préparation d'exosomes, les échantillons ont été dilués au 1:10 dans du PBS et filtrés sur un filtre en cellulose de taille de pores de 0,22 µm. Pour les échantillons filtrés, nous avons observé que les mesures effectuées à l'aide de l'angle arrière ont renvoyé une résolution de pic nettement meilleure que celles effectuées dans l'angle latéral. Pour l'analyse des données, le modèle étroit/avancé a été choisi par rapport au modèle général/avancé car il obtenait systématiquement une meilleure résolution de pic. Ainsi, l'angle de mesure arrière et le modèle d'analyse Narrow-Advanced ont été systématiquement retenus pour les mesures granulométriques sur échantillons filtrés pour la suite de l'étude. La plupart des résultats de distribution granulométrique de notre étude affichent 3 pics bien définis, avec un pic de grosses particules (200 nm, pic 1) correspondant aux débris cellulaires, un pic de particules de taille moyenne (30 nm, pic 2) correspondant aux exosomes, et, dans la plupart des cas, un pic discret de très petites particules (2 à 10 nm, pic 3) indiquant la présence de protéines flottantes. 

Effets de la dilution de l'échantillon

Ensuite, nous avons cherché à étudier l'effet de la dilution sur la taille des particules en comparant des échantillons dilués au 1:10 avec des échantillons dilués au 1:100 dans du PBS. Les distributions granulométriques étaient comparables pour les deux dilutions. La seule observation remarquable était que le pic d'exosomes (diamètres d'environ 30 nm) était plus important dans les dilutions 1:10 que dans les dilutions 1:100. 

Stabilité des exosomes à 4°C vs 37°C

Enfin, la stabilité des exosomes stockés jusqu'à une semaine a été étudiée en surveillant les changements de la taille des particules et du potentiel zêta au fil du temps. Deux températures de stockage différentes ont été comparées.

Stabilité : mesures de la taille des particules

La taille moyenne des particules du pic de l'exosome n'a enregistré que des fluctuations très mineures sur une semaine de stockage à 4°C, car la taille détectée n'a diminué que de 33,3 à 31,6 nm. Cela indique que la stabilité des exosomes est excellente lorsque les échantillons sont conservés à 4°C. En revanche, pour les échantillons conservés à 37°C, la taille des particules des exosomes était déjà significativement diminuée après 72 heures. 

De plus, le pic d'exosomes dans les échantillons stockés à 37°C pendant une semaine avait presque disparu. Cela suggère que les exosomes stockés à 37°C sont soumis à une dégradation rapide. 

Stabilité : mesures du potentiel zêta

Enfin, le potentiel zêta des préparations d'exosomes a été testé jusqu'à une semaine après l'isolement. Les variation du potentiel zêta sur 7 jours étaient relativement limitées, avec des valeurs pour les échantillons conservés à 4°C allant de -8 mV après isolement à -5 mV après une semaine, et de -8 mV à -6,5 mV sur la même période pour les échantillons conservés à 37°C. Cela indiquait que la surveillance du potentiel zêta n'était pas un paramètre significatif pour l'évaluation de la stabilité des exosomes. 

Cependant, les mesures du potentiel zêta fournissent des informations sur la charge de surface des exosomes et, par conséquent, sur leur interaction avec les systèmes biologiques. En effet, comme décrit par Ren et Coll, la charge négative sur les exosomes limite l'opsonisation des protéines. Ceci, à sont tour, ralentit leur clairance par le système réticulo-endothélial et augmente elur durée de vie in vivo.

4. Conclusion

Le suivi de la distribution granulométrique des préparations d'exosomes avec le Litesizer™ 500 nous a permis de caractériser les exosomes, de suivre leur stabilité et d'optimiser leurs conditions de stockage. Bien que les mesures du potentiel zêta n'aient pas fourni d'informations significatives sur la stabilité des exosomes pendant le stockage, la connaissance de leur charge de surface pourrait néanmoins donner des indices importants sur leur fonctionnalité biologique.