Comment Fabriquer et utiliser des tampons d'extraction d'ARN courants
Voici quelques instructions pour vous aider à préparer vos tampons et réactifs d'extraction d'ARN. En général, il est recommandé d'utiliser des méthodes de cisaillement mécanique ou enzymatique pour accélérer le processus et prévenir la dégradation de l'ARN. Cependant, les réactifs et les matériaux requis peuvent varier en fonction de votre projet spécifique.
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1.Utiliser l'extraction acide-guanidium-phénol pour les cellules et les tissus
Cette méthode est efficace pour extraire l'ARN total ou l'ARN viral, mais elle n'est généralement pas adaptée à la purification d'ARN courts tels que l'ARNsi, l'ARNmi, l'ARNg et l'ARNt.
Elle repose sur une technique d'extraction liquide-liquide, où les phases d'un échantillon aqueux sont séparées en utilisant une solution de phénol-chloroforme. Le thiocyanate de guanidium permet la répartition des acides nucléiques dans la phase aqueuse, tandis que les protéines se retrouvent dans la phase organique, en utilisant des conditions acides (pH 4-6). Sous ces conditions, l'ADN est poussé dans la phase organique, tandis que l'ARN est conservé dans la phase aqueuse. À l'inverse, dans des conditions neutres, l'ADN et l'ARN se répartissent dans la phase aqueuse.
Les étapes de base de cette méthode comprennent :
- Homogénéisation des cellules à l'aide de la solution de lyse cellulaire (et de la matrice de lyse si nécessaire).
- Transfert de l'homogénat dans un nouveau tube et ajout d'acétate de sodium, de phénol saturé d'eau, de chloroforme/alcool isoamylique ou de bromochloropropane - en mélangeant après chaque ajout - et incubation à une température fraîche.
- Centrifugation et transfert de la phase aqueuse supérieure (qui contient l'ARN) dans un nouveau tube.
- Précipitation, lavage et resuspension de l'ARN.
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2.Réactifs et recettes d'extraction d'ARN
Étape 1 - Solution de lyse cellulaire
Ingrédients finaux de la solution de lyse cellulaire :
- Thiocyanate de guanidine : 4 M
- Citrate de sodium : 25 mM
- Sarkosil : 0,5% (p/v)
- 2-Mercaptoéthanol (2-ME) : 0,1 M
Solution mère :
Mélanger les composants suivants :
- 293 ml d'eau
- 17,6 ml de citrate de sodium à 0,75 M, pH 7,0
- 26,4 ml de N-lauroylsarcosine (Sarkosyl) à 10 % (p/v)
- Ajouter 250 g de thiocyanate de guanidine
- Agiter à 60° à 65°C pour dissoudre
- Conserver jusqu'à 3 mois à température ambiante
Solution de travail (50 ml) :
- Mélanger 50 ml de solution mère
- Ajouter 0,35 ml de 2-mercaptoéthanol (2-ME)
- Conserver jusqu'à 1 mois à température ambiante
Étape 2 - Acétate de sodium 2 M, pH 4 et Phénol saturé d'eau
Acétate de sodium 2 M, pH 4 :
- Ajouter 16,42 g d'acétate de sodium (anhydre) à 40 ml d'eau et 35 ml d'acide acétique glacial.
- Ajuster la solution à pH 4 avec de l'acide acétique glacial
- Diluer à 100 ml avec de l'eau.
- Se conserve jusqu'à 1 an à température ambiante
Phénol saturé d'eau :
- Dissoudre 100 g de cristaux de phénol dans de l'eau à 60° à 65°C
- Retirer la phase aqueuse supérieure
- Conserver jusqu'à 1 mois à 4°C. Ne pas utiliser de phénol tamponné à la place du phénol saturé d'eau.
49:1 (v/v) chloroforme/alcool isoamylique (ou bromochloropropane) - Pas de recette fournie
Étape 3 - Transfert de la phase aqueuse
Centrifuger et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube - aucun réactif nécessaire
Étape 4 - Précipitation, Lavage et Remise en suspension
Précipitation : 100 % d'isopropanol
Lavage : 75 % d'éthanol
Pour 1 litre d'alcool à 95%, ajouter 294 ml d'eau DEPC.
Remise en suspension : eau traitée au DEPC
- Ajouter 1 mL de DEPC frais à 1 L d'eau
- Bien agiter pour disperser le DEPC à travers l'eau
- Incuber à 37°C pendant au moins 12 h et/ou autoclaver à 15 psi sur un cycle liquide pendant 20 min pour inactiver le DEPC restant.
