Comment Quantifier les protéines

Le dosage BCA est une méthode largement utilisée pour la quantification des protéines en raison de sa sensibilité et de sa facilité de réalisation. Mécaniquement, il implique deux réactions : la réaction de Biuret, où les ions cuivriques sont réduits par les protéines dans des conditions alcalines, et la chélation du BCA avec l'ion Cu+. La deuxième réaction entraîne un changement de couleur de l'échantillon, passant du bleu au violet, et produit un complexe BCA-cuivre stable qui absorbe la lumière à 562 nm.

Voici les réactifs nécessaires pour réaliser le dosage BCA :

• Solution A : 1 g de bicinchoninate de sodium (BCA), 2 g de carbonate de sodium, 0,16 g de tartrate de sodium, 0,4 g de NaOH et 0,95 g de bicarbonate de sodium, portés à 100 ml avec de l'eau distillée (ajuster le pH à 11,25 avec du NaOH 10 M).
• Solution B : 0,4 g de sulfate cuivrique (pentahydraté) dans 10 ml d'eau distillée.
• Solution de travail standard (stable pendant 1 semaine et doit être verte) : préparer un mélange de 50 volumes de Solution A pour 1 volume de Solution B.

Voici le protocole pour réaliser le dosage BCA :

1. Préparer les échantillons de protéines à une concentration de 0,2 à 50 µg/µL.
2. Ajouter 1 ml de solution de travail standard à chaque échantillon et vortexer.
3. Incuber les échantillons à 60°C pendant 30 minutes.
4. Refroidir les échantillons à température ambiante.
5. Mesurer l'absorbance à 562 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
6. Déterminez la quantité de protéines dans vos échantillons en comparant l'absorbance mesurée à une courbe standard d'absorbance préalablement préparée, en fonction des microgrammes de protéines.

En utilisant ce protocole et la courbe standard, vous pourrez quantifier les protéines présentes dans vos échantillons en fonction de l'absorbance mesurée.

Pour quantifier les protéines à l'aide du test de Bradford, vous pouvez suivre le protocole ci-dessous :

Réactifs :

• Vous pouvez utiliser une solution commerciale de Bradford préparée ou préparer votre propre solution selon les étapes suivantes :
  1. Dissoudre 100 mg de bleu brillant de Coomassie G-250 dans 50 ml d'éthanol à 95%.
  2. Ajouter 100 ml d'acide phosphorique à 85% (p/v).
  3. Diluer le mélange à 1 litre après une dissolution complète du colorant.
  4. Filtrer la solution juste avant utilisation. La solution de Bradford doit avoir une couleur marron clair.

Protocole :

1. Diluez votre échantillon de protéines si nécessaire.
2. Facultatif : Si les échantillons ne sont pas facilement solubles dans la solution de Bradford (si vous observez des grumeaux bleus), ajoutez un volume égal de NaOH 1 M à chaque échantillon et vortexez délicatement (pour éviter que l'échantillon ne déborde de la cuvette). Ajoutez également du NaOH aux standards si vous effectuez cette étape.
3. Préparez des standards contenant une gamme de concentrations de 5 à 100 microgrammes de protéines (l'albumine ou la gamma globuline sont recommandées) dans un volume de 100 µl.
4. Ajoutez 5 ml du réactif colorant de Bradford à chaque échantillon et aux standards, puis incubez le tout à température ambiante pendant 5 minutes.
5. Mesurez l'absorbance de chaque échantillon et des standards à une longueur d'onde de 595 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
6. De manière similaire au test BCA, comparez l'absorbance de vos échantillons à une courbe standard d'absorbance préalablement établie en fonction des microgrammes de protéines. Cela vous permettra de calculer la concentration de protéines dans vos échantillons d'origine.

En utilisant cette courbe standard, vous pourrez estimer la concentration en protéines de vos échantillons en fonction de l'absorbance mesurée lors de l'étape 5 du protocole.

Pour quantifier les protéines à l'aide de l'absorbance UV, suivez le protocole suivant :

1. Chauffez la lampe UV du spectrophotomètre pendant 15 minutes pour garantir sa stabilité.

2. Réglez la longueur d'onde du spectrophotomètre sur 280 nm, car c'est à cette longueur d'onde que les protéines absorbent principalement en raison de la présence d'acides aminés aromatiques tels que la tyrosine et le tryptophane, ainsi que de la phénylalanine et des liaisons disulfure qui contribuent également légèrement à l'absorbance.

3. Étalonnez la lampe UV à zéro absorbance en utilisant un blanc, qui est une solution tampon dépourvue de protéines. Cela permet de compenser l'absorbance due à la solution tampon elle-même.

4. Mesurez l'absorbance de votre solution de protéines en utilisant le spectrophotomètre réglé à 280 nm. Prenez en compte le blanc en soustrayant l'absorbance de la solution tampon à l'absorbance de votre échantillon de protéines.

5. Si vous suspectez une contamination par des acides nucléiques dans votre échantillon de protéines, vous pouvez effectuer une mesure supplémentaire à une longueur d'onde de 260 nm. Les acides nucléiques absorbent principalement à cette longueur d'onde. Ajustez donc la longueur d'onde du spectrophotomètre à 260 nm et répétez les étapes 3 et 4 pour mesurer l'absorbance à 260 nm de votre échantillon.

Une fois que vous avez mesuré l'absorbance à 280 nm et éventuellement à 260 nm, vous pouvez calculer la concentration en protéines en utilisant les formules suivantes :

• Pour une protéine pure dont vous connaissez le coefficient d'absorbance :
  • Concentration (mg/ml) = Absorbance à 280 nm divisée par le coefficient d'absorbance, en supposant une longueur de trajet de 1 cm.
• Pour des protéines ou des mélanges de protéines inconnus :
  • Concentration (mg/ml) = Absorbance à 280 nm divisée par la longueur de trajet (habituellement 1 cm).
• Pour des échantillons inconnus susceptibles d'être contaminés par des acides nucléiques :
  • Concentration (mg/ml) = (1,55 x A280) - (0,76 x A260).

La concentration pour les protéines pures connues peut être exprimée en mg/ml, en pourcentage ou en molarité, selon le coefficient utilisé. mg/ml = % de protéine/10 = molarité/poids moléculaire de la protéine.