Contrôle de la qualité des vaccins antiviraux avec le Litesizer

Problématique / Besoin :

La taille des particules des vaccins a une influence considérable sur leur demi-vie in vivo, ainsi que sur leur absorption par les cellules présentatrices d'antigène. La charge superficielle des particules est également suspectée d'influencer les mêmes paramètres. Ici, nous utilisons la DLS et l'ELS pour caractériser respectivementla taille des particules et le potentiel zêta de deux vaccins antiviraux inactivés. 

Un vaccin contre l'encéphalite à tiques (TBE) présente une distribution granulométrique monomodale dans la gamme inférieure du micromètre, correspondant à la taille attendue de l'adjuvant de sel d'aluminium. Un vaccin antigrippal à base de cellules, en revanche, contient à la fois des virus fractionnés (environ 30 nm) et des agrégats plus gros (environ 250 nm). Les mesures du potentiel zêta indiquent que les deux vaccins sont constitués de particules faiblement anioniques. Fait intéressent, nous démontrons que les perturbations simulées de la chaîne du froid (traitement thermique, congélation-décongélation) induisent des changements significatifs dans la distribution granulométrique des deux vaccins. 

Méthode utilisée / Réponse apportée :

1. Introduction

Les vaccins constituent souvent la seule ligne de défense contre les infections virales, car la gamme de médicaments antiviraux actuellement disponibles et le succès des traitements sont limités. La situation est différente pour les infections bactériennes, où les antibiotiques sont une intervention thérapeutique efficace. Les vaccins antiviraux peuvent être constitués de particules virales vivantes atténuées, qui produisent une infection à faible bruit chez le receveur. Bien que cette stratégie puisse imiter de très près une infection par l'agent pathogène et déclenche généralement une réponse immunitaire très robuste, elle a le potentiel d'effets secondaires graves chez les personnes immunodéprimées. Ainsi, la majorité des vaccins antiviraux consistent désormais en des formulations qui n'ont pas de potentiel de réplication chez l'hôte. Ceux-ci vont des virus entiers ou fractionnés chimiquement inactivés, aux protéines recombinantes ou aux particules de type virus produites par génie génétique. Bien que ces vaccins aient un meilleur profil de sécurité, ils ont également tendance à déclencher des réponses immunitaires plus faibles que leurs homologues vivants atténués. Par conséquent, beaucoup d'entre eux sont administrés avec des adjuvants dits vaccinaux, qui augmentent l'efficacité et la longévité de la réponse immunitaire. L'adjuvant de ce type le plus ancien et toujours le plus populaire est le sel d'aluminium (par exemple, l'hydroxyde d'aluminium ou l'hydroxyphosphate d'aluminium). On pense que ses propriétés immunostimulantes sont liées à la fois à sa capacité à adsorber et retenir les antigènes pendant de longues périodes au site d'injection, et à sa capacité à déclencher la libération locale de médiateurs pro-inflammatoires. La taille des particules d'un vaccin a un impact significatif sur son immunogénicité. A quelques exceptions près, les virus sont des nanoparticules dont la taille varie de 15 à 300 nm. Lors de l'injection, les particules de cette gamme de tailles sont efficacement absorbées par les cellules dendritiques, une classe de cellules sentinelles dotées uniquement de la capacité d'induire à la fois une immunité à médiation par les anticorps et les cellules tueuses. En revanche, les particules de l'ordre du micromètre, telles que les particules de sel d'aluminium, sont préférentiellement absorbées par les monocytes et les macrophages, qui induisent principalement une réponse immunitaire médiée par des anticorps. 

Sachant que la distribution des différentes classes de cellules dans le corps est fortement spécifique au tissu, la taille des particules d'un vaccin doit donc être adaptée : 

• sur la base du type de réponse immunitaire nécessaire pour contrer le pathogène
• en fonction de la voie d'administration du vaccin 
• La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est une méthode de mesure rapide et non invasive qui élucide la distribution de taille des particules dans la plage de tailles du nanomètre inférieur au micromètre inférieur. Cela fait du DLS une méthode de choix pour le contrôle de la qualité des vaccins antiviraux. Nous démontrons ici la capacité du Litesizer à déterminer la taille des particules de deux vaccins antiviraux, un vaccin contre l'encéphalite à tiques (TBE) inactivé avec adjuvant de sel d'aluminium et un vaccin antigrippal sans adjuvant, inactivé et fractionné. Nous avons simulé des perturbations de la chaîne du froid en comparant des échantillons stockés dans des conditions optimales à des échantillons traités thermiquement ou soumis à un cycle de congélation-décongélation. De plus, des mesures ELS ont été effectuées pour évaluer le potentiel zêta des particules de vaccin, donnant des indices supplémentaires sur la stabilité des préparations. 

2. Configuration expérimentale

Echantillons

Deux vaccins antiviraux ont été achetés dans une pharmacie locale : 

• Vaccin TBE (FSME-Immun, Pfizer, Autriche). Vaccin inactivé basé sur la souche Neudörfl de TBE. Le virus se propage dans les fibroblastes d'embryons de poulet et est inactivé par le formaldéhyde. L'hydroxyde d'aluminium est utilisé comme adjuvant et l'albumine sérique humaine comme stabilisant. Une dose consiste en 2,4 µg d'antigène viral dans 0,5 mL de diluant. 
• Vaccin contre la grippe (Flucelvax, Seqirus, Etats-Unis). Vaccin antigrippal quadrivalent contenant 2 souches de virus grippaux A et 2 souches de virus grippaux B, selon les lignes directrices de l'OMS pour la saison grippale 2019-2020 dans l'hémisphère nord. Les virus sont propagés dans la lignée cellulaire MDCK continue, inactivés par la b-propiolactone, désintégrés par un détergent et purifiés. Une dose est formulée pour contenir 15 µg d'hémagglutinine virale (HA) de chaque souche virale, ou 60 µg d'HA total, dans 0,5 mL. 

Traitement des échantillons

Avant le traitement, les vaccins ont été conservés dans leur conditionnement d'origine à +4°C, selon les recommandations du fabricant. Chaque échatillon a ensuite été divisé en 3 sous-échantillons dans des microtubes stériles, qui ont été stockés comme suit : 

• Un échantillon a ensuite été conservé à la température optimale de +4°C (échantillon "non traités")
• Un échantillon a été conservé dans un four sec réglé à 50°C pendant 24 heures, puis remis à +4°C (échantillon "traité thermiquement")
• Un échantillon a été congelé à -18°C pendant 24 heures, puis décongelé à +4°C (échantillon "congelé-décongelé"). 

Tous les échantillons ont été testés en parallèle, entre 24 et 28 heures après une collecte du conditionnement d'origine. 

Mesures DLS

Pour les mesure DLS, les échantillons de vaccin TBE ont été dilués au 1/10 dans une solution saline stérile (NaCI 0,9%). Les échantillons de vaccin antigrippal ont été dilués 1/5 dans une solution saline stérile. Ces dilutions ont été établies comme optimales pour les mesures DLS dans une expérience préliminaire (données non présentées). Les mesures ont été effectuées sur un instrument Anton Paar Litsizer 500. Par rapport aux cuvettes jetables (polystyrène), les cuves en quartz présentent des qualités optiques supérieures et une adsorption réduite des protéines, et ont donc été sélectionnées ici. Les mesures ont été effectuées à 25°C, dans l'angle de mesure de 175° (angle de retour) et en utilisant un mode de qualité manuel (12 essais, 10 secondes par essai). Le filtre optique et la position de mise au point ont été sélectionnés automatiquement par l'instrument. Les séries de répétitions comprenaient un minimum de 5 et un maximum de 8 mesures consécutives. Les résultats ont été moyennés sur toute la mesure. La signification statistique a été établie par un test t standard (deux échantillons, en supposant une variance inégale). Les différences entre les ensembles de données étaient considérées comme significatives lorsque la valeur P renvoyée était de <0,05. 

Mesures ELS

Les échantillons ont été analysés sous forme native, non diluée, à l'aide de l'Univette et de l'accessoire à faible volume (volume d'échantillon : 50 µL). Les mesures du potentiel zêta ont été effectuées sur un instrument Litesizer 500 à 25°C, et en utilisant le mode Protéine, qui introduit de petites pauses entre les cycles de mesure et limite donc l'échauffement Joule. La tension a été ajustée automatiquement par l'instrument. La qualité a été réglée sur le mode manuel, avec 200 analyses par mesure. Des séries de répétitions consistant en 5 mesures consécutives ont été réalisées. 

3. Résultats et discussion 

Mesure de la taille des particules des échantillons de vaccin TBE

La distribution granulométrique pondérée en intensité d'un vaccin TBE stocké de manière optimale ("Non traité") affiche un seul pic culminant entre 2 et 3 µm. Ceci est conforme à la taille de particule connue de l'hydroxyde d'aluminium commercial utilisé comme adjuvant de vaccin, qui est dans la gamme inférieure du micromètre. En outre, la distribution granulométrique des deux courbes moyennes et de toutes les mesures individuelles est entièrement dépourvue de pics dans la plage de 0 à 1000 nm. Cela indique que les particules virales ne sont pas détectables en tant qu'entités flottantes et sont probablement adsorbées de manière écrasante sur les particules d'adjuvant. 

Les distributions granulométriques des échantillons de vaccins congelés et traités thermiquement affichent des distributions monomodales de tailles légèrement agrandies. Ceci est confirmé par les résultats du diamètre hydrodynamique (HDD) obtenus pour ces échantillons. En effet, le HDD moyen de l'échantillon congelé-décongelé est légèrement mais significativement augmenté par rapport à celui de l'échantillon non traité, de 3030 à 3582 nm. L'échantillon traité thermiquement présente une augmentation plus prononcée du disque dur, de 3030 à 4030 nm. 

A noter, l'écart type du disque dur pour l'échantillon traité thermiquement est beaucoup plus grand que celui de l'échantillon non traié. Cette reproductibilité sous-optimale suggère que le Litesizer pourrait détecter de très gros agrégats dans l'échantillon traité thermiquement, qui ne peuvent pas être représentés avec précision car ils sont au-dessus de la limite de détection du Litesizer de 10 µm. Prises ensemble, ces données indiquent que le Litesizer est capable de mesurer la taille des particules d'un vaccin viral avec adjuvant de sel d'aluminium. Les particules détectées sont de la taille attendue pourl'hydroxyde d'alumunium. Fait intéressant, une augmentation significative du HDD est observée pour les échantillons de vaccins traités thermiquement et congelés, ce qui indique que des perturbations majeures de la chaine du froid favorisent l'agrégation des adjuvants. 

Mesure de la taille des particules d'échantillons de vaccin antigrippal

La taille attendue du virus de la grippe vivant est d'environ 100 nm, mais il a été démontré que l'inactivation et la séparation des détergents réduisent la taille des particules primaires dans les préparations vaccinales. La distribution granulométrique de l'échantillon de vaccin antigrippal non traité montre une distribution bimodale, avec un pic majeur culminant autour de 250 nm et un pic mineur culminant autour de 30 nm. Ainsi, nos résultats suggèrent que le vaccin à l'étude est composé de particules virales fractionnées de diamètre autour de 30 nm, et d'agrégats de plus grandes tailles. 

Parce que les grosses particules contribuent beaucoup plus fortement au signal DLS que les plus petites, le fait que les grosses particules dominent visuellement la distribution n'indique pas nécessairement que la majeure partie du matériau est sous forme agrégée. En fait, lorsque la distribution granulométrique est passée d'une distribution pondérée en intensité à une distribution basée sur le volume ou basée sur le nombre, le pic global a disparu et seul le pic mineur (environ 30 nm) était visible. Cela indique que les particules primaires sont beaucoup plus nombreuses que les agrégats. Cependant, étant donné que la méthode DLS est intrinsèquement pondérée en intensité et que la caractérisation des agrégats est très pertinente pour le contrôle de la qualité des vaccins, nous avons effectué l'analyse des résultats exclusivement sur les données pondérées en intensité. Les préparations traitées thermiquement et congelées conservent un profil bimodal, mais que des différences subtiles dans la distribution des tailles proviennent du traitement. L'échantillon traité thermiquement montre un pic majeur d'amplitude réduite et un pic mineur d'amplitude accrue. Fait intéressant, l'échantillon congelé-décongelé présente un comportement opposé, avec un pic majeur de magnitude accrue et un pic mineur de magnitude réduite. Cela suggère que la congélation-décongélation a tendance à augmenter l'agrégation des particules virales fractionnées, tandis que le traitement thermique la réduit. En plus du disque dur, qui est calculé sur toute la distribution, le logiciel Litesizer calcule le diamètre moyen des particules contenues dans jusqu'à pics individuels dans la distribution. En outre, l'aire sous la courbe est calculée pour chaque pic, indiquant la contribution relative des particules dans les pics concernés au signal DLS. 

Les résultats de l'aire sous la courbe pour le pic 1 et le pic 2 confirment les différences entre les échantillons observés dans la distribution granulométrique. La contribution des particules primaires au signal DLS augmente de 16 à 24% lorsq ue l'échantillon est traité thermiquement. A l'inverse, les particules primaires ne représentent que 11% du signal DLS dans l'échantillon congelé-décongelé. 

Ces résultats indiquent que des différences subtiles mais significatives dans la proportion relative de particules primaires et d'agrégats peuvent être détectées efficacement par DLS. Nos observations suggèrent également que le traitement thermique et la congélation-décongélation ont des effets opposés sur le comportement d'agrégation des particules de grippe inactivées, la congélation-décongélation favorisant l'agrégation tandis que le traitement conduit à la désagrégation. 

Mesure du potentiel zêta des échantillons de vaccin TBE et antigrippal

La charge superficielle des particules, mesurée par leur potentiel zêta, est couramment utilisée comme indicateur de stabilité colloïdale. Plus le potentiel zêta absolu est grand, plus les forces de répulsion entre les particules sont importantes et plus la préparation sera stable. Mais, dans le cas de particules destinées à une administration in vivo, il est également démontré que la potentiel zêta influence l'absorption des particules par des cellules spécifiques. Sur les exosomes, il a été démontré que les charges négatives limitent l'opsonisation des protéines. Ceci, à son tour, ralentit leur clairance par le système réticulo-endothélial et augmente leur durée de vie in vivo. D'autres rapports indiquent que les nanoparticules cationiques sont préférentiellement absorbées par les cellules dendritiques et entrainant une augmentation des réponsés immunitaires locales, par rapport à leurs homologues anioniques. Dans l'ensemble, cela suggère que la mesure du potentiel zêta est très pertinente pour le contrôle de la qualité des préparations vaccinales. Ici, le potentiel zêta des échantillons de TBE (non traités, traités thermiquement ou congelés) a été mesure avec l'Univette et son accessoire à faible volume, qui a permis des mesures avec aussi peu que 50µL d'échantillon. Le potentiel zêta des particules de vaccin TBE peut être mesuré efficacement avec le Litsizer, avec une bonne répétabilité. Le potentiel zêta moyen apparait faiblement négatif, et n'est pas sensiblement modifié par le traitement thermique ni par la congélation-décongélation. L'échantillon de vaccin antigrippal présente également des valeurs de potentiel zêta faiblement négatives, qui ne son pas non plus significativement modifiées par le traitement thermique ni par la congélation-décongélation. En règle générale, les colloïdes sont considérés comme stables lorsque les valeurs du potentiel zêta absolu sont supérieures à 30 mV. On peut donc supposer que la faible magnitude du potentiel zêta observée ici pour les deux vaccins explique leur tendance à s'agréger en réponse aux perturbations de la chaine du froid. 

4. Conclusion

La taille et le potentiel zêta des particules sont tous deux pertinents pour la durée de conservation et l'immunogénicité des préparations vaccinales. Nous démontrons ici que le Litsizer est un outil rapide et efficace pour la caractérisation des vaccins antiviraux. Le vaccin TBE, qui est adjuvé avec du sel d'aluminium, est constitué de particules dans la gamme inférieure du micromètre, comme prévu dans la littérature. Dans le vaccin antigrippal, qui est dépourvu d'adjuvant, on observe à la fois des virus fractionnés et des agrégats plus gros. Pour les deux vaccins, des perturbations simulées de la chaine du froid (traitement thermique ou congélation-décongélation) se révèlent déclencher des changements subtils mais significatifs dans la distribution granulométrique. Des mesures du potentiel zêta ont également été réalisées avec succès, démontrant que les deux vaccins sont constitués de particules faiblement anioniques. Les perturbations de la chaine du froid ne semblent pas modifier de manière significative la charge superficielle des particules de vaccin.