Comment Isoler l'ADN du sang

Lorsque vous décidez de la méthode d'isolation de l'ADN à partir de sang, la prise en compte du moment de l'utilisation de l'échantillon et de son stockage est essentielle. La qualité de l'ADN génomique isolé dépend de la qualité du matériel de départ, qui est fortement influencée par la manière dont vous stockez et préparez vos échantillons.

Le plasma du sang total contient des nucléases qui peuvent menacer l'intégrité de l'ADN. Tant que les leucocytes restent intacts, ces nucléases n'endommageront pas l'ADN. Vos méthodes de stockage et de préparation des échantillons auront un impact sur la stabilité des leucocytes et de l'ADN qu'ils renferment. Voici quelques conseils pour préserver l'intégrité de votre ADN cible :

1. Ne conservez pas les échantillons de sang frais entre 4 et 8 °C pendant plus d'une semaine. Le stockage à 4 °C pendant une période prolongée rend les leucocytes de plus en plus instables et expose l'ADN aux nucléases, ce qui réduit la taille de l'ADN purifié.

2. Évitez d'utiliser des échantillons de sang le jour même, car ils peuvent être difficiles à lyser, et obtenir une pureté constante de l'ADN entre les échantillons peut être compliqué. Conservez plutôt les échantillons de sang frais entre 4 et 8 °C pendant 2 à 3 jours avant de commencer le processus de purification.

3. Si vous n'avez pas l'intention d'utiliser vos échantillons de sang total dans quelques jours, conservez-les à -80 °C pour obtenir un ADN de haute qualité. Cependant, évitez de décongeler ces échantillons avant la purification.

Il est important d'éviter de décongeler des échantillons de sang total congelés, car lorsque l'échantillon gèle, des cristaux de glace se forment, endommageant les leucocytes et permettant aux nucléases de dégrader rapidement l'ADN nécessaire. Pour préserver l'intégrité de l'ADN, congelez les échantillons tout en ajoutant les composants de lyse, puis incubez-les immédiatement à 56 °C, ce qui protégera l'ADN et permettra d'obtenir de grands fragments d'ADN.

1. Stockez la protéinase K (et la RNAse si utilisée) à -20 °C.
2. Refroidissez vos solutions de lyse et PBS sur de la glace.
3. Préparez vos tampons de lavage conformément au protocole indiqué.
4. Réglez un bain-marie ou un bloc chauffant à 56 °C pour la lyse des échantillons.
5. Préchauffez le volume approprié de tampon(s) d'élution à 60°C.
6. Si vous travaillez avec plusieurs échantillons, préparez un mélange maître du tampon de lyse, de la protéinase K et de la RNAse pour minimiser le pipetage. Vous pouvez omettre la RNase A si une faible contamination par l'ARN n'affecte pas vos applications ultérieures.
7. Étiquetez soigneusement vos tubes pour éviter de mélanger vos échantillons.
8. Portez des gants et nettoyez votre surface de travail avec de l'alcool pour prévenir toute contamination et dégradation de l'ADN.

Sang total de mammifère :

1. Transférer 100 µl de sang total dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml (ajouter du PBS froid pour atteindre un volume total de 100 µl).
2. Ajouter la protéinase K, la RNase A et le tampon de lyse (ou votre mélange maître préparé) et vortexer immédiatement. Pour le sang congelé, ne pas décongeler - ajouter les enzymes et le tampon de lyse (ou le mélange maître) à l'échantillon congelé et procéder immédiatement.
3. Incuber pendant 5 minutes à 56°C tout en vortexant de temps en temps.
4. Passer à la liaison à l'ADN et à l'élution.

Sang total nucléé :

1. Transférer 10 µl de sang total dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Ajouter 90 µl de PBS froid et mélanger en vortex.
3. Ajouter la protéinase K et la RNase A et vortexer immédiatement (ne pas ajouter le tampon de lyse en même temps).
4. Ajouter le Lysis Buffer et vortexer (la solution deviendra visqueuse).
5. Incuber pendant 5 minutes à 56°C tout en vortexant de temps en temps.
6. Passer à la liaison à l'ADN et à l'élution.

En option, vous pouvez également utiliser des matrices de lyse pour lyser vos échantillons.

Colonnes de centrifugation en silice :

1. Ajoutez un tampon de liaison à votre échantillon lysé et mélangez soigneusement.
2. Appliquez votre échantillon sur la colonne en veillant à ne pas perturber la membrane, à ne pas surcharger la colonne et à ne pas toucher la membrane.
3. Effectuez une centrifugation (la vitesse et la durée dépendent du kit) pour piéger l'ADN sur la membrane. Transférez ensuite la colonne dans un nouveau tube propre.
4. Appliquez le tampon de lavage et effectuez une centrifugation à vitesse maximale (> 12 000 xg) pendant 1 minute pour permettre aux contaminants de traverser la membrane. Jetez le flux à travers (répétez selon votre protocole spécifique).
5. Transférez la colonne dans un tube propre sans DNase.
6. Appliquez le tampon d'élution préchauffé (100 µl) sur la membrane, incubez à température ambiante pendant 1 minute, puis centrifugez à vitesse maximale (> 12 000 xg) pendant 1 minute pour libérer l'ADN.
7. Répétez si nécessaire selon les instructions spécifiques de votre kit.

Billes magnétiques :

1. Mélangez l'échantillon lysé avec le tampon de liaison.
2. Appliquez les échantillons sur les tubes (ou puits) contenant des billes magnétiques, permettant à l'ADN de se lier aux billes.
3. Lavez les billes avec le tampon de lavage, en agitant doucement l'échantillon.
4. Utilisez un support magnétique pour maintenir les billes en place et retirez et jetez le tampon de lavage.
5. Répétez les étapes de lavage selon les instructions spécifiques de votre kit (par exemple, le kit d'extraction d'ADN sanguin MPure a trois tampons de lavage différents).
6. Appliquez votre tampon d'élution sur les billes lavées, agitez les tubes pour libérer l'ADN dans la solution.
7. Placez vos tubes sur le support magnétique et pipetez l'éluant dans un nouveau tube propre sans DNase. Répétez l'étape d'élution selon les instructions spécifiques de votre kit.

Après l'isolement, quantifiez l'ADN purifié en utilisant la spectrophotométrie. Vous pouvez soit utiliser immédiatement l'ADN purifié pour votre analyse en aval, soit le stocker pour une utilisation ultérieure.

Pour le stockage, conservez l'ADN purifié à une température de -20 °C. Évitez de procéder à des cycles répétés de congélation et de décongélation de l'ADN, car cela peut altérer sa qualité. En suivant ces recommandations, vous maintiendrez l'intégrité de l'ADN pour vos futures applications.

Pour isoler l'ADN du sang avec MP Bio, vous avez le choix entre des réactifs économiques et des systèmes automatisés à haut débit. Vous pouvez obtenir les matrices de lyse, les réactifs, les colonnes de centrifugation, les tubes de récupération, et d'autres équipements individuellement, ou opter pour un kit complet comprenant tout le nécessaire.

Voici quelques options de kits disponibles :

1. Kit d'ADN de tissus et d'insectes FastDNA-96, 2 x 96 préparations : Ce kit permet une extraction rapide et à haut débit de l'ADN génomique prêt pour la PCR à partir d'échantillons d'animaux et d'insectes, y compris le sang total.

2. Kit d'extraction d'ADN sanguin MPure, 48 préparations : Ce kit permet la purification automatisée de l'ADN génomique à partir du sang total ou de la couche leucocytaire, tout en offrant une solution économique. Pour utiliser ce kit, vous aurez besoin de l'instrument MPure-12™ Système automatisé de purification des acides nucléiques.

3. Kit d'isolation d'ADN GNOME® : Ce kit est conçu pour isoler l'ADN génomique de poids moléculaire élevé à partir de cellules sanguines, de globules blancs nucléés et d'autres cellules et tissus de mammifères.

Avec ces options de kits, vous pourrez facilement isoler l'ADN du sang en fonction de vos besoins spécifiques, que ce soit pour des analyses à haut débit ou pour des applications de PCR.