Comment Optimiser votre méthode de lyse cellulaire

Pour commencer la préparation de vos échantillons, il est crucial de mettre en place une méthode de lyse cellulaire fiable et reproductible. La lyse cellulaire constitue la première étape pour obtenir l'ADN, l'ARN, les protéines ou tout autre analyte que vous souhaitez analyser à partir de votre échantillon. Étant donné que le protocole spécifique que vous utilisez peut avoir un impact considérable sur la qualité, le rendement et la représentativité des molécules extraites, il est essentiel de consacrer du temps à l'optimisation de votre méthode.

Il existe de nombreuses méthodes de perturbation cellulaire parmi lesquelles vous pouvez choisir, et le choix idéal dépendra de divers facteurs tels que le type d'échantillon et l'application en aval.

Pour optimiser votre méthode, vous devrez peut-être effectuer l'une ou plusieurs des activités suivantes :

1. Assurer un environnement de travail propre pour minimiser la dégradation et la contamination.
2. Sélectionner et comparer différentes méthodes de rupture cellulaire pour déterminer celle qui convient le mieux à votre échantillon spécifique.
3. Choisir un tampon de lyse approprié, adapté aux caractéristiques de vos cellules et à l'analyte que vous souhaitez extraire.
4. Déterminer la température optimale pour la rupture cellulaire, car certaines méthodes peuvent nécessiter des conditions thermiques spécifiques.
5. Ajuster le volume d'échantillon, la vitesse de traitement, les temps d'incubation et d'autres variables au sein de votre protocole pour obtenir les meilleurs résultats.

Lorsque vous atteignez la dernière étape de votre procédure d'extraction et que vous évaluez la qualité et la concentration de votre ADN, ARN ou protéine, vous souhaitez obtenir des résultats optimaux. Une bande de gel claire et nette, un rapport A260/A280 adéquat au spectrophotomètre, ou une coloration bleue intense dans votre solution Bradford sont des indicateurs souhaitables.

Malheureusement, ce n'est pas toujours le cas. Une fois que les cellules sont lysées, l'ADN, l'ARN et les protéines deviennent vulnérables à la dégradation, à la dénaturation et à la contamination par des DNases, des RNases, des protéases et diverses particules endogènes ou potentiellement exogènes.

En utilisant les bonnes techniques de préparation et de prévention, vous pouvez maximiser le rendement et la pureté de vos molécules, vous permettant de passer sans encombre à la phase suivante de votre expérience.

Conseils pratiques pour protéger vos molécules avant et pendant la rupture cellulaire :

• Nettoyez soigneusement votre plan de travail, votre équipement et votre verrerie en utilisant une solution à base d'alcool, des produits de nettoyage de laboratoire appropriés, ou RNase Erase (pour la manipulation de l'ARN).
• Utilisez des tubes et des embouts de pipette exempts de DNases et de RNases.
• Portez des gants et des équipements de protection individuelle (EPI) tout au long de vos méthodes de lyse et d'extraction cellulaire.
• Si nécessaire, ajoutez des réactifs inhibant les RNases, les DNases et les protéases à votre tampon de lyse.
• Utilisez systématiquement des embouts de pipette neufs et évitez de les réutiliser entre les échantillons ainsi qu'entre les échantillons et les tampons et réactifs.

Différentes méthodes de lyse cellulaire sont plus adaptées à certains types d'échantillons. Par exemple, la lyse osmotique et chimique convient aux bactéries, aux levures et aux champignons, tandis que le broyage des billes est idéal pour les plantes résistantes (et pratiquement tous les types d'échantillons).

Voici un aperçu des méthodes de lyse cellulaire courantes, accompagnées de plusieurs facteurs à prendre en compte dans chacune des cinq catégories suivantes. Par exemple, lorsque vous utilisez le broyage des billes, vous pouvez optimiser votre méthode en choisissant le matériau, la taille et la forme de la matrice de lyse appropriés.

Homogénéisation mécanique

• Description : Utilise la force pure pour briser les cellules. Cela peut être réalisé en utilisant des billes physiques (c'est-à-dire des matrices de lyse), des dispositifs portables tels qu'un mortier et un pilon, ou des lames rotatives (par exemple, un moulin à billes).
• Types d'échantillons appropriés : Tous les types d'échantillons, des cellules bactériennes facilement lyser aux os résistants.

Homogénéisation par ultrasons

• Description : Produit de l'énergie mécanique à partir d'ondes sonores à haute fréquence, créant des bulles microscopiques qui génèrent des ondes de choc dans l'échantillon.
• Types d'échantillons appropriés : Lots de petites cellules, bactéries et petits échantillons de tissus.

Traitements thermiques

• Description : Implique plusieurs cycles de congélation dans de la neige carbonique (ou un bain de glace) et de décongélation à température ambiante. Pendant la congélation, des cristaux de glace se forment, brisant la paroi cellulaire.
• Types d'échantillons appropriés : Cellules bactériennes et mammifères.

Homogénéisation sous pression

• Description : Utilise des homogénéisateurs à haute pression pour forcer les échantillons liquides à travers un espace étroit.
• Types d'échantillons appropriés : Bactéries à Gram positif.

Lyse osmotique et chimique

• Description : Gonfle les cellules ou ouvre les cellules en utilisant une solution hypotonique ou des détergents.
• Types d'échantillons appropriés : Bactéries, levures et champignons.

Le choix du tampon de lyse approprié et des réactifs spécifiques dont vous aurez besoin dépendra du type d'échantillon, de l'analyte cible (acides nucléiques ou protéines) et de l'application en aval.

Les kits d'extraction commerciaux, tels que les kits d'isolement d'ADN et d'ARN de MP Bio, fournissent des tampons de lyse spécifiquement optimisés pour les types d'échantillons prévus. Si vous ne utilisez pas de kit et que vous préparez votre propre tampon, vous pouvez envisager de tester différents types de tampons de lyse sur un petit sous-ensemble d'échantillons.

Conseils pour préparer des tampons de lyse en laboratoire :

1. Testez le pH et ajustez-le si nécessaire : Le pH de votre tampon est crucial pour le succès de votre méthode de lyse cellulaire. Si vous utilisez des méthodes d'extraction liquide-liquide basées sur des gradients de densité, le pH aide à positionner les différents analytes dans les phases du gradient de solution appropriées. Un pH incorrect pourrait entraîner le déplacement de vos molécules cibles vers une phase inattendue qui serait finalement éliminée.

2. Modifiez et testez les protocoles standards : Bien que certains tampons de lyse conviennent mieux aux cellules de mammifères qu'aux tissus végétaux, tous les tissus végétaux ne sont pas identiques et vous devrez peut-être ajuster les méthodes standard pour développer votre protocole idéal. Nous vous suggérons de consulter la littérature lorsque vous travaillez avec des échantillons uniques ou particulièrement difficiles afin de voir si vos pairs ont développé une solution modifiée qui s'est révélée efficace pour des échantillons similaires au vôtre.

Les différentes méthodes de disruption cellulaire comportent des variables que vous pouvez ajuster pour optimiser votre protocole. Voici quelques variables courantes pour commencer :

Température de lyse : De nombreuses méthodes peuvent entraîner une élévation de la température des échantillons, favorisant ainsi l'activité des RNases, DNases ou protéases. Maintenir les échantillons sur de la glace ou à des températures cryogéniques peut aider à ralentir l'activité enzymatique et à préserver la stabilité de vos molécules.

Temps d'incubation : La durée pendant laquelle vous incubez vos cellules dans le tampon de lyse peut influencer le rendement du produit final. Dans de nombreux cas, une incubation pendant la nuit peut être préférable, mais il est important de prendre en compte que des températures plus fraîches peuvent être nécessaires pour des périodes d'incubation plus longues.

Paramètres de vitesse et de cycle : La lyse cellulaire implique souvent une agitation, telle que le vortex ou une autre méthode d'agitation. La modification de la vitesse d'agitation, du temps entre les cycles d'agitation et de la durée totale de l'agitation peut avoir une incidence sur le rendement du produit final.

N'oubliez pas que des données fiables commencent par une bonne préparation des échantillons, donc prenez le temps d'optimiser votre protocole. En ajustant ces variables clés, vous pouvez améliorer l'efficacité de la rupture cellulaire et obtenir des acides nucléiques et des protéines de haute qualité pour vos applications en aval.