Comment Préparer des échantillons d'ADN aquatique

Il est essentiel de noter que, avant de débuter la collecte et l'extraction, il peut être nécessaire de traiter les échantillons en fonction de leur type spécifique et des objectifs du projet. Par exemple, les sédiments marins contiennent souvent de gros débris et peuvent nécessiter un filtrage et un lavage à travers un tamis à mailles, un filtre à café ou une gaze afin de prévenir tout problème tout au long du processus de collecte et d'extraction.

Selon le type d'échantillon que vous utilisez et ce que vous souhaitez évaluer, il peut être nécessaire de rendre votre échantillon homogène afin de capturer intégralement l'eDNA présent. Les systèmes de battement de billes, tels que les instruments FastPrep de MP Bio et la matrice de lyse E de MP Bio, sont efficaces pour la lyse mécanique et l'homogénéisation. Ils sont largement utilisés pour préparer des échantillons environnementaux en vue de l'isolement de l'ADN à partir d'une multitude de types d'échantillons, notamment des échantillons aquatiques et des sédiments marins.

Trois principales méthodes de collecte d'ADN environnemental (ADNe) à partir d'échantillons d'eau sont couramment utilisées : la filtration, la précipitation et l'ultrafiltration centrifuge.

Filtration : La filtration est la méthode la plus répandue, car elle permet de traiter de grands volumes d'échantillons et d'obtenir des rendements élevés d'ADNe. La taille des pores et le matériau du filtre sont importants pour la collecte d'ADNe en fonction du type d'échantillon. Les filtres avec des tailles de pores de 1 à 10 μm sont généralement efficaces pour capturer l'ADNe des macro-organismes, tandis que des tailles de pores inférieures à 1 μm peuvent être nécessaires pour l'ADNe des micro-organismes. Les échantillons contenant de gros débris ou une turbidité élevée peuvent obstruer les filtres, nécessitant ainsi un préfiltrage.

Précipitation : La précipitation de l'ADN avec de l'isopropanol ou de l'éthanol est couramment utilisée pour les petits volumes d'échantillons d'eau lorsque la concentration d'ADNe de l'espèce d'intérêt est élevée. Cette méthode nécessite moins d'équipement et convient aux études menées dans des endroits difficiles d'accès ou sans accès à l'électricité.

Ultrafiltration centrifuge : Cette méthode est utilisée pour concentrer et purifier l'ADN, éliminant ainsi le besoin de réactifs supplémentaires lors de la collecte d'ADNe à partir d'échantillons d'eau. Elle implique la récupération de l'ADN de grande taille dans le rétentat, tandis que les molécules plus petites et l'ADN linéarisé plus grand passent à travers la membrane et se retrouvent dans le filtrat. Cette méthode est idéale pour traiter de nombreux échantillons de petits à modérés volumes, et peut être associée aux méthodes de filtration décrites précédemment pour les grands volumes d'échantillons, en capturant l'ADNe sur un filtre approprié, en le remettant en suspension dans de l'eau ultrapure et en le collectant par ultrafiltration.

L'extraction et la purification de l'ADN peuvent être réalisées à l'aide de kits commerciaux d'extraction d'ADN ou d'une méthode de séparation en phase liquide, telle que la méthode CTAB. Les kits d'extraction d'ADN commerciaux sont plus largement utilisés, probablement en raison de leur meilleure récupération, efficacité et reproductibilité. Cependant, il existe de nombreux kits disponibles, et les performances de chaque kit dépendent de la méthode de collecte d'ADN environnemental utilisée et de l'état de l'échantillon, notamment de l'abondance d'inhibiteurs.

Lors d'une étude comparative de différents kits d'extraction d'ADN commerciaux, Eichmiller et al. ont constaté que le kit FastDNA™ SPIN de MP Bio produisait la concentration la plus élevée d'ADN environnemental de carpes et était le plus sensible pour la détection de l'ADN. De même, Liu et al. ont démontré que le kit FastDNA™ SPIN pour sol surpassait quatre autres kits commerciaux dans l'extraction de l'ADN environnemental à partir des communautés de plancton d'un réservoir d'eau douce.

Avant de procéder au séquençage de l'ADN environnemental (ADNe), il est important de mesurer la concentration et la pureté de l'ADNe. Cela peut être réalisé en utilisant un spectrophotomètre, qui permet d'évaluer les caractéristiques optiques de l'échantillon d'ADNe.

Le spectrophotomètre permet de mesurer l'absorbance de la lumière à différentes longueurs d'onde, ce qui permet de déterminer la concentration d'ADNe. La mesure de l'absorbance à une longueur d'onde spécifique permet d'estimer la quantité d'ADNe présente dans l'échantillon.

De plus, le spectrophotomètre peut également fournir des informations sur la pureté de l'ADNe en évaluant le rapport entre les absorbances à différentes longueurs d'onde. Les ratios typiquement utilisés pour évaluer la pureté de l'ADNe sont le ratio A260/A280 et le ratio A260/A230. Un rapport proche de 1,8-2,0 pour le ratio A260/A280 et un rapport supérieur à 1,8 pour le ratio A260/A230 indiquent une bonne pureté de l'ADNe.

En mesurant la concentration et la pureté de l'ADNe à l'aide d'un spectrophotomètre, vous pouvez vous assurer que votre échantillon d'ADNe est de qualité suffisante pour être utilisé dans le séquençage et obtenir des résultats fiables.

Pour résoudre les problèmes courants lors de la collecte et de l'extraction d'ADN environnemental (eDNA) et optimiser la qualité des échantillons, voici quelques recommandations :

Filtre bouché :

• Homogénéisez votre échantillon avant la filtration pour disperser les particules et éviter l'obstruction du filtre.
• Préfiltrez votre échantillon à travers un tamis ou un filtre plus grossier pour éliminer les débris volumineux avant la filtration finale.
• Augmentez le nombre de répliques de filtres pour augmenter les chances de collecter suffisamment d'ADNe.

Contamination de l'échantillon :

• Utilisez des porte-filtres jetables pour éviter toute contamination due à un nettoyage insuffisant entre les échantillons.
• Recueillez et conservez l'eDNA sur des filtres à capsules Sterivex-GP pour minimiser le risque de contamination externe.
• Portez des gants lors de la manipulation des échantillons et assurez-vous de les changer entre la collecte et l'extraction d'ADNe pour éviter la contamination croisée.

ADN dégradé :

• Extraites l'eDNA de votre échantillon dès que possible, de préférence dans les 24 heures suivant le prélèvement, pour minimiser la dégradation de l'ADN.
• Stockez l'ADN extrait à -20°C jusqu'à ce que vous soyez prêt à effectuer le séquençage ou d'autres applications ultérieures.
• Si vous homogénéisez votre échantillon avant la collecte, utilisez une matrice de lyse moins agressive pour éviter la dégradation de l'ADN.

Manque de reproductibilité :

• Utilisez un système automatisé tel que le MPure-12™ pour minimiser la variabilité du pipetage et assurer une cohérence entre les échantillons.
• Dépannez et optimisez votre méthode de collecte en identifiant les sources potentielles d'erreurs et en ajustant les paramètres de collecte en conséquence.
• Pour les échantillons à haut débit, utilisez les kits sol/microbes FastPrep-96 ainsi que FastPrep-96 pour obtenir une reproductibilité constante et des résultats cohérents.