Comment Fabriquer et utiliser des tampons d'extraction d'ADN courants
L'isolement de l'ADN à partir de cellules peut être réalisé en employant diverses solutions de lyse, parfois combinées à des méthodes mécaniques. Les agents chimiques couramment utilisés dans les solutions de lyse incluent le Tris, l'EDTA, le SDS, le CTAB, le Triton X100, le MgCl2, le KCl, le NaCl, ainsi que d'autres agents détergents.
En sélectionnant les solutions appropriées et en suivant la méthode adéquate pour extraire l'ADN, vous serez en mesure de :
- Rompre les membranes cellulaires et nucléaires de manière efficace,
- Maintenir un pH optimal tout au long du processus d'extraction,
- Sauvegarder l'intégrité de l'ADN et prévenir sa dégradation,
- Séparer l'ADN des débris cellulaires et des contaminants.
La formulation idéale de la solution de lyse dépendra du type d'échantillon que vous traitez. Pour des applications particulièrement sensibles à la contamination, il peut être judicieux d'opter pour des kits d'isolement d'ADN éprouvés ou des solutions de lyse préfabriquées.
Il est également important de noter que l'utilisation de billes de lyse avec des matrices de lyse est souvent combinée avec les solutions de lyse afin d'augmenter l'efficacité de la procédure et d'obtenir un rendement en ADN maximal.
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1.Solutions d'extraction d'ADN à partir d'échantillons végétaux
Les solutions d'extraction reposant sur le CTAB sont fréquemment employées pour purifier l'ADN à partir de tissus végétaux, car elles facilitent la séparation des polysaccharides. L'introduction de polyvinylpyrrolidone (PVP) peut également contribuer à l'élimination des polyphénols.
Ingrédients et formulations :
- Tampon d'extraction CTAB (pH 8)
- Tris-Cl 100 mM, pH 8,0
- EDTA 20 mM, pH 8,0
- NaCl 1,4 M
- 2 % (p/v) CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium)
- 1 % PVP 40 000 (polyvinylpyrrolidone)
- 0,3 % de 2-β-mercaptoéthanol (ajouté directement avant utilisation dans une hotte)
- Chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v)
- NaCl 6 M
- Acétate de potassium 3 M
- Glace froide
- Alcool isopropylique à 100 %
- Éthanol à 70 %
- Réhydratation dans un tampon TE 1 × (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 ; EDTA 1 mM, pH 8,0, autoclavé)
- Tampon d'extraction CTAB (pH 8)
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2.Solutions pour l'isolation d'ADN plasmidique
L'extraction de l'ADN plasmidique d'Escherichia coli en utilisant une méthode de lyse alcaline est une technique bien établie. Les bactéries renfermant le plasmide sont lysées grâce à une solution SDS/NaOH. L'introduction d'acétate de potassium concentré provoque la coagulation des protéines et de l'ADN chromosomique, tandis que l'ADN plasmidique demeure en solution, permettant son isolement ultérieur par le biais d'une colonne de silice.
Ingrédients et instructions :
- Solution de Remise en Suspension
- Tris HCl à une concentration de 50 mM, pH 8
- EDTA à une concentration de 10 mM
- RNase A à une concentration de 100 µg/ml
- Solution de Lyse
- NaOH à une concentration de 0,2 N
- 1 % de FDS (sodium dodécyl sulfate)
- Acétate de potassium à une concentration de 3/5 M, pH 6 (solution de neutralisation)
- Isopropanol
- Éthanol à 70 %
- Réhydratation/Éluat dans de l'eau ou une solution tampon TE
Les échantillons présentant une diversité bactérienne complexe ou inconnue, comme dans le cas de la métagénomique, sont plus exigeants. Pour en savoir davantage sur les défis associés à la métagénomique et les stratégies pour les surmonter, il est recommandé de consulter des ressources spécialisées.
- Solution de Remise en Suspension
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3.Solutions pour l'extraction d'ADN à partir de cellules de mammifères
Le tampon de lyse des cellules de mammifères est fréquemment employé pour préparer les cellules en vue de leur traitement ultérieur sur une colonne de centrifugation commerciale, en vue de l'isolement de l'ADN. Le tampon sans RNase peut être préalablement mélangé et conservé à température ambiante.
Ingrédients et instructions :
Solution de Lyse d'ADN
- EDTA à une concentration de 0,1 M (pH 8,0)
- 0,5 % (p/v) de FDS
- Tris-Cl à une concentration de 10 mM (pH 8,0)
- RNase pancréatique sans DNase à une concentration de 20 μg/ml (à ajouter juste avant utilisation)
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4.Solutions pour l'extraction d'ADN à partir d'échantillons de sang
Procurez-vous de l'ADN à partir de sang humain, qu'il soit frais ou congelé.
Ingrédients et procédures :
- Tampon de Lyse pour les Globules Rouges (pH 7,6) :
- NH4Cl à une concentration de 0,155 mol/L
- KHCO3 à une concentration de 10 mmol/L
- EDTA (Na2) à une concentration de 0,1 mol/L
- Ajouter 20 μg/ml de RNase pancréatique sans DNase juste avant l'utilisation
- Tampon d'Extraction à base de CTAB (pH 8,0) :
- Tris à une concentration de 1,5 mol/L, pH 7,6
- Sel disodique d'acide éthylènediaminetétraacétique (Na2 EDTA) à une concentration de 0,4 mol/L
- NaCl à une concentration de 2,5 mol/L
- CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) à une concentration de 2 %
- SDS (dodécylsulfate de sodium) à une concentration de 10 %
- β-mercaptoéthanol
- Mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (24:1)
- Isopropanol
- Éthanol à 70 % et 90 %
Ces solutions vous aideront à extraire l'ADN de manière efficace à partir d'échantillons de sang.
- Tampon de Lyse pour les Globules Rouges (pH 7,6) :
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5.Dissolution des spermatozoïdes et solutions d'extraction d'ADN
Les méthodes d'extraction d'ADN généralement employées pour les cellules somatiques humaines se révèlent inefficaces pour les spermatozoïdes, en raison de la compaction nucléaire et de la stabilité de l'ADN propre à ces cellules.
Ingrédients et directives :
- Tampon de Lyse (10x) : 50 mL
- 5 ml de Tris-HCl à une concentration de 1 M
- 1 ml de NaCl à une concentration de 5M
- 2,5 ml de MgCl2 à une concentration de 1 M
- 41,5 ml d'eau
- 500 µL de solution ARN-Plus
- 50 µL de protéinase K
- 500 µL de chloroforme
- Ajouter 800 µL d'éthanol froid pur et 40 µL de citrate de sodium 3 M, maintenus à basse température
- Utiliser de l'éthanol à 70 %
- Pour la Réhydratation : utiliser Tris–HCl ou de l'eau distillée et déionisée (ddH2O).
Ces étapes sont essentielles pour dissoudre les spermatozoïdes et extraire l'ADN de manière appropriée.
- Tampon de Lyse (10x) : 50 mL
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6.Évaluation spectrophotométrique de la quantité d'ADN
Effectuez une évaluation précise du rendement et de la pureté de l'ADN en utilisant un spectromètre, tel que le NanoDrop, en mesurant aux longueurs d'onde 260 nm, 280 nm et 230 nm. Selon la concentration obtenue, il se peut que vous ayez à diluer une petite portion de votre échantillon pour garantir une lecture fiable et précise.
