Comment Utiliser la méthode d'extraction au phénol chloroforme

Familiarisez-vous avec les éléments avec lesquels vous allez travailler : de nombreux réactifs associés à cette méthode présentent des dangers potentiels, donc il est impératif de consulter la fiche de données de sécurité avant de manipuler ces substances.

Le phénol peut être rapidement absorbé par la peau, pouvant provoquer de sévères brûlures aux yeux, à la peau, voire endommager vos vêtements. Cette réaction est encore plus intense lorsque le phénol est combiné avec du chloroforme. Le chloroforme peut entraîner des irritations cutanées et oculaires, et il est suspecté d'être cancérigène pour l'homme ainsi que nuisible à la reproduction.

Il est essentiel d'établir des pratiques de travail spécifiques, notamment :

• Effectuer les manipulations impliquant le phénol ou le chloroforme dans une enceinte de sécurité chimique.
• Se laver les mains minutieusement immédiatement après avoir manipulé ces produits chimiques.
• Tenir fermement les tubes et les bouchons pendant l'agitation pour prévenir tout risque d'éclaboussures en cas d'ouverture du bouchon.
• Porter l'équipement de protection individuelle approprié : gants, protection oculaire, blouse de laboratoire, pantalon et chaussures fermées.
• Réserver la manipulation de ces matériaux aux utilisateurs expérimentés.
• Entreposer le phénol à l'écart des oxydants puissants et le chloroforme à distance des substances alcalines.
• Éliminer correctement les réactifs et les équipements à usage unique pour la manipulation des liquides en les déposant dans des poubelles de déchets dangereux clairement étiquetées.

Réactif : Glycogène (20 μg/μL) Objectif : Le glycogène est employé en tant que support pour faciliter la précipitation de l'ADN et pour aider à rendre le précipité d'ADN visible.

Réactif : NH4OAc 7,5 M (acétate d'ammonium) Objectif : L'acétate d'ammonium (ou un autre sel) agit conjointement avec l'éthanol pour provoquer la précipitation de l'ADN, tandis que les glucides et les dNTP demeurent en solution.

Réactif : Mélange phénol:chloroforme:alcool isoamylique (PCI) (25:24:1) Vous pouvez préparer la solution vous-même ou acquérir une solution prête à l'emploi. Objectif : La solution PCI génère deux phases liquides distinctes : la phase aqueuse contenant l'ADN et la phase phénolique contenant les protéines. Étant donné que le mélange phénol/chloroforme possède une densité supérieure à celle de l'eau, la phase aqueuse contenant l'ADN se positionne au-dessus de la phase phénolique après la centrifugation.

Réactif : Éthanol à 100% Objectif : L'éthanol (ou éventuellement l'isopropanol) est utilisé pour précipiter et concentrer l'ADN. La précipitation des acides nucléiques au moyen d'alcool repose sur le principe de la séparation en présence de sels (comme l'acétate d'ammonium), ce qui rend les acides nucléiques insolubles.

Réactif : Éthanol à 70% Objectif : On utilise un mélange de 70 à 80% d'éthanol pour effectuer le lavage du précipité d'ADN avant de procéder au séchage et à la remise en suspension.

1. Ajoutez un volume de mélange phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) à votre échantillon (Tube 1), en prenant des proportions égales d'échantillon et de solution PCI, puis effectuez une agitation vigoureuse pendant une minute à l'aide d'un vortex.
2. Centrifugez à une force de 16 000 × g à température ambiante pendant 5 minutes. Transférez délicatement la phase aqueuse supérieure (contenant l'ADN) dans un nouveau tube de microcentrifugeuse d'une capacité de 1,5 ml (Tube 2), en veillant à ne pas transférer de phase phénolique inférieure lors du pipetage.
3. Effectuez une précipitation à l'éthanol ou suivez le protocole optionnel ci-dessous, pour optimiser le rendement de l'ADN : a. Ajoutez 200 µL de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 au Tube 1, puis effectuez une agitation vigoureuse pendant une minute. b. Centrifugez le Tube 1 à 16 000 × g à température ambiante pendant 5 minutes. c. Transférez prudemment la solution aqueuse supérieure du Tube 1 au Tube 2, en évitant tout transfert de la couche de phénol inférieure dans le Tube 2. d. Ajoutez des volumes équivalents de la solution de chloroforme/alcool isoamylique (24:1) (préparée ou commerciale) au Tube 2, puis effectuez une agitation vigoureuse pendant une minute. e. Centrifugez le Tube 2 à 16 000 × g à température ambiante pendant 5 minutes. f. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube (Tube 3), en évitant tout transfert de la phase chloroforme/alcool isoamylique.
4. Procédez à la précipitation à l'éthanol selon les étapes appropriées.

1. Ajout des réactifs suivants à la phase aqueuse, dans l'ordre précisé ci-dessous :

   • Intégrez le NH4OAc pour obtenir une concentration finale de 0,75 M.
   • Incorporer 1 µL de glycogène (20 µg) et homogénéisez le mélange.
   • Inclure un volume équivalent à 2.5X de l'échantillon + NH4OAc d'éthanol 100% (Mélange).

2. Incubation du tube à une température de -20°C pendant une nuit en vue de la précipitation de l'ADN. En alternative, une incubation dans de la neige carbonique ou à -80°C pendant au moins 1 heure peut être réalisée.

3. Procéder à une centrifugation de l'échantillon à 4 °C pendant 20 à 30 minutes à 16 000 × g, pour assurer la sédimentation de l'ADN. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le dépôt.

4. Laver le dépôt en ajoutant entre 150 μL et 300 μL d'éthanol à 70 %. Centrifugez l'échantillon à 4°C pendant 2 minutes à 16 000 × g. Enlevez le surnageant avec précaution.

5. Réitérez l'étape 3 et éliminez tout résidu d'éthanol restant autant que possible. Comme alternative, une étape supplémentaire de lavage (étape 4) peut être effectuée, suivie de la centrifugation de l'échantillon selon la même procédure qu'à l'étape 3.

6. Effectuez un séchage à l'air du dépôt d'ADN à température ambiante pendant une période de 5 à 10 minutes.

7. Pour reconstituer le dépôt d'ADN séché, effectuez un mouvement de pipetage de haut en bas dans du Tris-HCl 10 mM à pH 8,5.